Dua puluh empat tahun kemudian, Kalinyamat kembali mengirim ekspedisi melawan Portugis di Malaka.
Kali ini lebih besar: 300 kapal, 80 kapal di antaranya adalah kapal jung, dengan 15 ribu pasukan.
Lagi-lagi, ekspedisi ini gagal mengusir Portugis dari Malaka.
meski begitu, serangan ini tak pelak membuat bangsa kulit putih itu takut dan jera berhadapan dengan penguasa Jepara itu.
Konon katanya, sampai sekarang di Malaka masih ada kompleks kuburan yang tempat "Tentara Jawa" dimakamkan.
Ratu Kalinyamat meninggal pada 1579 dan dimakamkan di desa Mantingan, Jepara, di sebelah makam suaminya Pangeran Hadirin.