Selain faktor usia dan penyakit kronis, ada dugaan bahwa Sultan Agung meninggal karena terkena wabah penyakit yang melanda Jawa pada tahun 1640-an.
Sejarawan M.C. Ricklefs dalam bukunya Sejarah Indonesia Modern, 1200–2004, menyebutkan, "Wabah-wabah penyakit merajalela pada tahun 1640-an, dan kematian Sultan Agung mungkin sekali disebabkan oleh salah satu wabah tersebut."
Wabah penyakit tersebut diduga adalah pes atau tifus yang menyebar melalui tikus atau nyamuk.
Penyakit ini bisa menyebabkan demam tinggi, sakit kepala, muntah-muntah, bengkak-bengkak di leher atau ketiak, dan bercak-bercak hitam di kulit.
Jika tidak ditangani dengan baik, penyakit ini bisa berakibat fatal.
Namun, ada juga spekulasi bahwa Sultan Agung dibunuh oleh musuhnya, baik dari dalam maupun luar kerajaan.
Salah satu yang dicurigai adalah Tumenggung Wiraguna yang mengambil alih pemerintahan saat Sultan Agung sakit.
Ada yang mengatakan bahwa ia meracuni makanan atau minuman Sultan Agung agar bisa menggantikannya sebagai raja.
Selain itu, ada juga kemungkinan bahwa Sultan Agung dibunuh oleh VOC yang ingin menghentikan perlawanan Mataram. VOC mungkin menyusupkan agen-agen rahasia atau mata-mata yang berhasil membunuh Sultan Agung dengan cara licik.
Sayangnya, tidak ada bukti kuat atau saksi mata yang bisa membuktikan teori-teori tersebut.
Sultan Agung meninggal dunia pada tahun 1646, kira-kira antara awal Februari dan awal April.
Dia dimakamkan di kompleks makam Imogiri yang ia bangun sendiri.