Desas-desus menyebar bahwa Darnley telah dibunuh di bawah perintah Mary oleh orang kepercayaannya James Hepburn, Earl of Bothwell ke-4 dan penasihat terkemuka untuk Mary.
Bothwell dibebaskan dari tuduhan pembunuhan Darnley, tetapi keraguan yang tersisa makin diperkuat karena setelah persidangan selesai, Bothwell menikahi Ratu Skotlandia tersebut.
Pernikahan mereka dilihat oleh sebagian besar sebagai bukti bahwa keduanya telah bersekongkol dalam kematian Darnley.
Mary dikecam sebagai pezina dan pembunuh.
Hal ini menyebabkan konfrontasi antara tentara Mary dan Bangsawan Skotlandia di Carberry Hill, dekat Edinburgh, pada tanggal 15 Juni 1567.
Tentara Mary dikalahkan dan dia kemudian dipenjarakan di Kastil Loch Leven.
Suami barunya Bothwell melarikan diri ke Skandinavia di mana dia ditangkap dan dipenjarakan juga.
Putranya James, yang baru berusia satu tahun, diambil darinya dan diberikan mahkotanya.
Saat dipenjara, Mary melahirkan bayi kembar yang lahir mati.