Pagi hari 10 Februari 156, sebuah ledakan misterius di rumah Kirk o 'Field di luar Edinburgh, menewaskan Lord Darnley. Mary adalah tersangka langsung.
Rumor menyebar bahwa Darnley telah dibunuh di bawah perintah Mary oleh James Hepburn, orang kepercayaan ke-4 Earl of Bothwell dan penasihat terkemuka untuk Mary.
Bothwell dibebaskan dari tuduhan pembunuhan Darnley, tetapi keraguan yang tersisa justru semakin kuat ketika, hampir segera setelah persidangan selesai, ia menikahi Ratu Skotlandia.
Perkawinan ketiga Mary dengan Bothwell tidak lebih bahagia dari pernikahan keduanya. Bothwell memiliki ambisinya sendiri untuk menjadi Raja dan menggunakan kekuasaannya atas Mary untuk mencoba mewujudkan ambisinya.
Tetapi sebagian besar pernikahan mereka dipandang sebagai bukti bahwa keduanya bersekongkol dalam kematian Darnley.
Mary dikecam sebagai pezina dan pembunuh. Petingginya yang Protestan memberontak melawannya.
Hal ini menyebabkan konfrontasi antara pasukannya dan Bangsawan Skotlandia di Carberry Hill, dekat Edinburgh, pada 15 Juni 1567. Pasukan Mary dikalahkan dan dia kemudian dipenjara di Kastil Loch Leven.
Suami barunya, Bothwell, melarikan diri ke Skandinavia tempat dia ditangkap dan dipenjara juga. Mary tidak akan melihatnya lagi.
Putranya James, yang baru berumur satu tahun, diambil dari Mary dan diberikan mahkotanya. Sementara dipenjara Mary melahirkan anak kembar yang lahir mati.